(一)定性試驗

1.丙烯酸試驗

參照硫酸化油定性試驗中的丙烯酸試驗。

2.紅外吸收光譜法

表面活性劑的IR光譜集，從SadderResearch Laboratories得到。還有Hummell的光譜和解說書內容豐富，便于了解。測譜時，防止可能有不純物的混入是很重要的。原因是由于不純物的存在，甘油脂肪酸酯的原有的光譜被干擾。因此，測譜前，希望精制以使不含甘油酯以外的物質，但是，事實上，不知道試樣是甘油酯的場合是較多的。因此，通過測譜得到試樣的大致的管能團的情報，如果是混合物的話，再用薄層色譜(TLC)，液體色譜。或者萃取操作等分離，進行精制以后，再測譜，可得到明確的譜。

甘油硬脂酸酯的光譜(圖1)各吸收帶歸屬如下：3333 cm^-1 (VOH)，2940 cm^-1 (V_asCH)，2860 cm^-1 (V_sCH)，1730 cm^-1 (v c=o),1175 cm^-1 (vc-o-c)，ll00 cm^-1 (δ0H)，1050 cm^-1 (δ伯OH)，720 cm^-1 (CH₂橫向)，在油酸和其他飽和酸酯的場合，在3030 cm^-1 (VcH)處產生肩形峰，另外，對于反式次亞乙烯增加1660 cm^-1 (V c=c)和720 cm^-1 (δCH面外)的吸收，特別在720 cm^-1的吸收帶比飽和脂肪酸酯寬闊。

圖1單硬脂酸甘油酯的紅外吸收光譜

單酯羥基的3333 cm^-1吸收帶很強，二酯很小，三酯則全部消失。

3.NMR光譜法

NMR光譜法對于單獨的每個分子中的管能團也有許多情報可提供，所以一般對于構造大體明確的試樣再用來加以詳細的研究。

試樣必須全部充分干燥，必須除去未反應物、副產物、不純物等精制的甘油酯試樣溶于四氯化碳中，將約0.4ml試樣加入外徑為0.5cm的NMR光譜測定用玻璃管中測譜，這種場合，在0.4m1中希望包含數+毫克的試樣，加入l％～2％四甲基硅烷作內標物，光譜中的化學位移以δ值或者r值(r=10.0-δ)表示，而最近以δ值表示的多。圖2為甘油的單脂肪酸酯的NMR光譜。

圖2 單油酸甘油酯的核磁共振吸收光譜

δ=0.9(油酸基的末端甲基質子)；δ=1.3(羥基的質子和與雙鍵不鄰接的亞甲基質子)；δ=2.O(鄰接雙鍵的二個亞甲基質子)；δ=2.3(位于羧基口位的質子)；

δ=3.5(甘油基的3位置的2個質子)；δ=3.7(甘油基的2位置的質子)；

δ=4.1(甘油基的l位置的2個質子)；δ=5.3(雙鍵的質子)

 (二)結構分析

由IR光譜僅能進行甘油脂肪酸酯的確認，酯化度的推定也有某種可能。再聯合NMR光譜，則烷基鏈等詳細結構也可以明確。但是，僅這些，不能完全知道單一、二.、三脂肪酸酯的比例和脂肪酸組成。在這種場合，一般應利用氣相色譜，在這里，除將試樣直接注入氣相色譜儀中以外，還有進’行預先三甲基硅醚法、乙酰化、烯丙酯化等處理的分析方法。甘油的定性檢定和脂肪酸組成的確定是將皂化后脂肪酸制備成甲酯，用直接酯交換法甲酯化，同時將得到的甘油直接或者習慣上進行三甲硅醚化、乙酰化等處理后分別作氣相色譜分析，還有習慣上用氫化鋁鋰進行還原分解，將生成的甘油和高級醇經三甲基硅醚化后也作氣相色譜分析，用液體色譜也能分離單一、二、三酯，另外，測定皂化價，羥價，摩爾質量也可能分析出來，由碘價測定也能知道親油基不飽和程度。

1.氣相色譜分析

(1)直接法  由于甘油酯缺乏揮發性，所以進行一般試樣分析的場合，降低液相濃度，縮短層析柱的長度等辦法是必要的。但是單脂肪酸酯和二脂肪酸酯由于極性強，即使直接注入氣相色譜儀，分離也差，本方法是專門用于三脂肪酸酯(三甘酯)的方法。層析柱長0.5m，外徑3.2mm。擔體ChromosorbW250180ttm(60～80目)，固定液硅酮SE.30。涂布量2.25％。層析溫度200→320℃程序升溫，載氣(N₂)流速  l50ml／min。

作為固定液也可用和SE-30相同的硅酮系QF-1和JXR。

(2)三甲基硅醚化甘油的單脂肪酸酯和二脂肪酸酯不僅是揮發性差，而且由于分子中殘留著羥基而呈極性強，直接作氣相色譜分析是困難的。將試樣三甲基硅醚化轉換成揮發性物質以后，進行氣相色譜的方法，由于操作比較簡單，而經常被采用。

取(1mg以上)試樣于15ml帶玻璃塞的沉淀管中，加入lml吡啶，再加入0.2ml六甲基硅胺和0.1ml三甲基氯硅烷，振蕩15～30s混合后，放置5min，加入己烷和水各5ml，振蕩混合，己烷層轉入別的容器中，再加入5ml己烷于水層中。重復同樣的操作兩次以上，合并己烷層，加入無水硫酸鈉除去水分后，吹入氮氣，蒸發除去己烷，得至三甲基硅醚化物，在下列條件下進行氣相色譜分析：①層析柱為φ6.4mm×lm的銅管，固定液為聚二乙二醇琥珀酸酯(DEGS)，擔體為ChromosorbW，涂布量20％，層析溫度215℃。②用涂布l5％阿皮松L的30m的毛細管(內徑0.76mm，外徑1.58mm)從180℃到240℃進行程序升溫分析，對于鑒定器來說，最近也有用氫火焰離子化鑒定器的(FID)。

用在不銹鋼管(φ3.2mm×lm)中，填充涂布了30g／kgJXR的擔體的層析柱也能分析(圖3)。用在同樣的管中填充涂布50g／kg硅酮SE-52的層析柱也是分析實例。

圖3 單甘酯和二甘酯三甲基硅醚化物的氣相色譜

1一單油酸酯；2一單硬脂肪酸酯；3一二棕櫚酸醑；4一棕櫚酸油酸酸；5一棕櫚酸硬脂酸酯；6一二油酸酯；7一二硬脂酸酯

(3)乙酰化法  將試樣和等容量的乙酰氯一起回流45min乙酰化后，減壓除去乙酰氯，將得到的乙酰化物注入氣相色譜儀。

對于乙酰化的方法，最近有專門利用吡啶和醋酸酐的方法。即將lOmg試樣溶解于0.5ml吡啶和0.5ml醋酸酐中，回流1h，冷卻后用乙醚萃取，將萃取液經多次洗滌、洗凈后，用無水硫酸鈉脫水，蒸餾除去溶劑，得到乙酰化物。

(4)皂化后進行甲酯化的方法  取1.5～2g試樣于200ml皂化燒瓶中，加入25ml KOH乙醇溶液[c(KOH)=0.5mol／L]，在燒瓶上安裝冷凝管(長lm，外徑0.6～0.8cm)，一邊時常搖混內容物，一邊調節加熱溫度以使回流的乙醇蒸汽不達到冷凝管上端，讓沸騰1h，濃縮內容物后，用鹽酸溶液[c(HCl)=6mol／L]使呈酸性，在80℃加熱1h，冷卻后用50ml乙醚萃取3～5次，將萃取物用30ml水洗至甲基橙指示劑不呈酸性止，用無水硫酸鈉脫水，過濾后，讓乙醚蒸發，取殘留物于酯化燒瓶中，加入30ml硫酸一甲醇溶液(加lml濃硫酸于100ml甲醇中)溶解，在燒瓶上安裝冷凝管加熱，讓沸騰lh后，冷卻。加入100ml水，用石油醚萃取兩次，將全部萃取液用30ml水反復洗滌，直到洗凈液對甲基橙不呈酸性止，石油醚溶液用無水硫酸鈉脫水后，蒸餾除去石油醚，將得到的脂肪酸甲酯注入氣相色譜儀，用2m長的300g／kgDEGS層析柱，在180℃分析，另一方面，乙醚萃取后的殘留的水溶液用KOH溶液[c(KOH)=0.1mol／L]中和后，在水浴上溫和地加熱，進行濃縮，然后立即冷卻，用5～20ml異丙醇萃取，濃縮萃取物，進行氣相色譜分析，層析柱使用長lm的300g／kgCarbowax20M，層析溫度200℃。

對于將脂肪酸甲酯化的方法，一般采用將脂肪酸和甲醇在酸性催化劑的存在下進行回流的方法。酸性催化劑除本法使用的硫酸外，也用鹽酸，對甲苯磺酸等，另外，三氟化硼時常被用作催化劑，其他使用重氮甲烷甲酯化適用也很廣。重氮甲烷法的特征是在常溫下能迅速甲酯化。

另外，由水層得到的甘油經三甲基硅醚化后，也可作氣相色譜分析。

(5)用酯交換反應直接甲酯化的方法

在1.8～2g試樣中加入10倍量的鹽酸無水甲醇溶液(3％，體積)，一邊通入N₂氣，一邊溫和地回流5h，濃縮內容物后，用50ml乙醚和50ml水，數次萃取，水洗，萃取液用無水硫酸鈉脫水，低溫下蒸留除去醚，作氣相色譜分析。水層加入KOH溶液[c(KOH)=0.1mol／L]中和后濃縮，用5～20ml異丙醇萃取。萃取液濃縮后進行氣相色譜分析。

Stoffel等將少量(1～10mg)試樣溶解在0.5ml鹽酸甲醇溶液(5％)和0.5ml苯中，然后進行甲酯化。

在酯交換法中，除此以外，還有用三氟化硼，甲醇鈉，甲醇鉀，2，2-二甲氧基丙烷的方法。

(6)用氫化鋁鋰分解法  取約lOOmg試樣于lOOml茄形瓶中，溶解在20ml無水乙醚中，將200mg氫化鋁鋰溶解在30ml無水乙醚中，取上層澄清液，每次少量地加入試樣溶液中后，回流30min。冷卻后，加入數滴水和少量稀鹽酸，再加入水并移入分液漏斗中，水層和醚層分離，將各層分別減壓濃縮，濃縮物分別溶解于數ml無水吡啶中，取lml放在帶塞的小試管中，加入0.2ml六甲基二硅胺和0.1ml三甲基氯硅烷，激烈振蕩混合物30s靜置5min后，加入3ml氯仿溶解，用數ml水數次洗滌，除去吡啶后，蒸餾除去氯仿，稀釋殘留物，作氣相色譜分析。

層析柱為長1.5m，內徑0.3cm的不銹鋼柱。擔體為l75～150μm(80～100目)的Gas ChromQ。固定液為硅酮SE-30。涂布量l5g／kg，層析溫度100→250℃，升溫速率為4℃／min。

2.液體色譜分析

在單脂肪酸酯、二脂肪酸酯、三肪酸酯的混合物的場合，利用填充硅膠的層析柱能夠達到各自分離，而所用沖洗劑依次為：①苯；②苯一乙醚(90：10)；③乙醚。苯沖洗三脂肪酸酯，苯-乙醚沖洗二脂肪酸酯，乙醚沖洗單脂肪酸酯。

3.總單硬脂酸甘油酯含量的測定

單甘酯有兩種結構即α-單酯和β-單酯，它們之間存在轉位平衡

β-單酯較不穩定，一般占總單酯的3％～10％，新制成的產品可達l2％～l3％。由于兩種單酯具有完全相同的使用效果，因此評價產品質量以總單酯為標準。非催化高碘酸氧化法只能測定α-單酯。有用高氯酸作催化劑，使β-單酯與α-單酯達到轉位平衡，然后使催化劑失活后再用高碘酸氧化α-單酯，所得結果再乘以平衡系數。

催化高碘酸氧化法本法采用轉位同時氧化，即β-單酯在高氯酸催化下，不斷向α-單酯轉位，并被高碘酸氧化。產物碘酸及過量高碘酸都用碘化鉀還原成碘，然后用硫代硫酸鈉標準溶液滴定。

①試劑高碘酸一冰醋酸溶液將2.7g高碘酸用約300ml冰醋酸加熱溶解，再用冰醋酸稀釋至l000ml，搖勻，放置l天后待用。

高氯酸溶液，56％。

碘化鉀溶液，200g/L。

硫代硫酸鈉標準溶液，c(Na₂S₂0₃)=0.1mol／L。氯仿。淀粉指示液，l0g/L。

②測定  精確稱取0.07g樣品(準確至0.0002g)，溶于25ml氯仿中，加入0.07ml高氯酸溶液(56％)，用移液管移取25ml高碘酸一冰醋酸溶液，搖勻，靜置35min。加入10ml碘化鉀溶液(200g／L)，于暗處靜置5min后加入50ml水，用硫代硫酸鈉標準溶液[c(Na₂S₂0₃)=0.1mol／L]滴定近終點時加入lml淀粉指示液(10g/L)，繼續滴定至藍色消失為終點。

在相同條件下做空白試驗。

總單甘酯含量的質量分數X按式(6—7)計算

(6.7)

式中  V₀——空白試驗消耗硫代硫酸鈉的體積，ml；

V——試驗滴定消耗硫代硫酸鈉的體積，ml；

c——硫代硫酸鈉標準溶液的實際濃度，mol／L；

M——單甘酯的毫摩爾質量，g／mmol；

m——試樣的質量，g。