雜細胞主要是植物纖維原料中的薄壁組織,由于長徑比小、纖維短,在造紙過程中被排入廢水而污染環境,其數量每年達數十萬噸之多。但雜細胞已經過不同程度的物理、化學處理,脫除了部分木質素,纖維素含量很高,且結晶度降低了,是一種較好的產酶誘導物。我們已對酶法水解雜細胞最適條件及酶回收利用進行了研究,本文以麩皮、稻草粉及雜細胞為碳源,雜細胞作產酶誘導物,通過里氏木霉固態發酵生產纖維素酶,旨在變廢為寶,進一步提高纖維素酶生產的經濟效益。

1材料與方法

1.1　雜細胞

　　該原料來自雅安市名山縣蒙頂紙業有限公司。該廠慈竹紙漿用80目篩篩分,篩上為良漿,篩下即為雜細胞,將其洗凈風干后貯于廣口瓶中供使用。其主要成分為纖維素64.34%,多戊糖20 .81%,木質素11.27%,灰分6.37%。

1.2　菌種

　　產酶菌株:里氏木霉(Trichoderma reesei),由四川農業大學應用微生物系提供。

1.3　培養基

　　里氏木霉斜面培養基:麩皮100ｇ,蔗糖20ｇ,瓊脂20ｇ,水1000mL,pH自然;28～30℃培養4～5ｄ備用。

1.4　產酶條件試驗

　　采用多因素試驗正交優選法得出最佳產酶培養基,確定以下因素及水平進行試驗(表1)。

表1　三因素組合設計表

碳源、氮源(總氮量為0.4%)及水分按要求組合,加入營養鹽磷酸二氫鉀(0. 1%)、硫酸鎂(0. 1%)、醋酸鈉(0. 1%)以及生長因子維生素Ｃ(0 .1%),pH自然,充分混勻,在121℃滅菌40min。

1.5　固態發酵

　　在500mL三角瓶中進行,每瓶裝料約1～2cm厚。用無菌水將孢子配制成懸浮液(每毫升約含孢子1010個),每瓶接入2mL,攪拌均勻后將三角瓶置于28℃恒溫培養箱中靜止培養,保持一定濕度,約16h翻曲1次,2d后扣瓶,定期取樣測定酶活,以確定最高酶活。

1.6　所產纖維素酶酶解最適ｐＨ及溫度的測定

　　在其它條件都相同的情況下,分別在下列pH值及溫度測CMC酶活。

　　pH:3,4,4 5,4 85,5,6,7

　　溫度:30℃,40℃,50℃,60℃,70℃

1.7　酶活的測定

　　酶液制備:稱取2g酶曲,加20毫升蒸餾水,30℃浸提1h,過濾,取濾液測定酶活。同時另稱取酶曲測水分系數。

　　酶活力的測定:按照國際理論和應用化學協會推薦的標準方法測定羧甲基纖維素酶活(簡稱CMC酶活),以國際單位(IU)表示。1個國際CMC酶活力單位等于酶水解反應中每分鐘由羧甲基纖維素鈉(CMC)生成1μmol葡萄糖的酶量。

2結果與討論

2.1　產酶條件正交試驗結果

　　根據表1所列因素及水平,采用Ｌ₁₆(4⁵)正交表進行試驗。結果是:雜細胞、稻草粉及麩皮三者之比為2∶4∶4,硫酸銨為氮源,料水比1∶2時,CMC酶活最高,達516. 64IU/ｇ干曲。三因素中,氮源在Ｆ0.1水平對結果有顯著性影響(Ｆ=3,6>Ｆ0.1(3,6)=329)。

2.2　里氏木霉產酶條件分析

2.2.1　雜細胞添加量　里氏木霉所產的纖維素酶是一種胞外酶,也是一種誘導酶,其生物合成需有作用底物或底物類似物的誘導,但也受到分解代謝產物的阻遏。誘導作用的強弱因誘導物而異,也與誘導物的濃度有關。當誘導物超過一定濃度時,在酶作用下所轉化的葡萄糖來不及消耗時,會引起分解代謝阻遏。本研究以雜細胞為產酶誘導物,改變雜細胞、稻草粉、麩皮三者的比例進行制曲試驗,結果(表2)當三者比例為2∶4∶4時CMC酶活性最高。

表2　雜細胞添加量對CMC酶活的影響

2.2.2　氮源　在總氮量固定的情況下,試驗不同氮源及其組合對產酶的影響,結果(表3)單用硫酸銨作氮源酶活力最高。尿素由于使培養物pH偏堿而不利于產酶。加入0 .05%的蛋白胨無明顯效果,并不如文獻報道有機氮與無機氮配合使用能使酶活成倍增長。

表3　氮源對CMC酶活的影響

2.2.3　培養基含水量對產酶的影響　在固態發酵過程中,底物含水量是一個重要的工藝參數。培養基的濕度(即水分)和發酵空氣中的相對濕度對微生物菌體的生物繁殖和產酶關系很大。采用相同培養基成分,改變料水比進行產酶實驗,結果如圖1所示。

圖1　水分對纖維素酶活性的影響

　由圖1可看出,最適底物含水量為固液比1∶2。在此條件下,每克酶曲(干重)的CMC酶活可達2370. 42IU。當底物含水量太高時,培養基內部空隙減小,氧滲透量小,酶曲中菌絲生長不良,不利于纖維素酶的形成。而當料水比為1∶1 5時,培養基過干菌種生長困難。

2.2.4 Tween80對產酶的影響　在本試驗的底物條件下添加0.1%的Tween80,其增產效果不足1%(圖2)。

2.2.5　培養時間的確定　本試驗在雜細胞、稻草粉、麩皮三者之比為2∶4∶4,料水比1∶2,硫酸銨作氮源,進行里氏木霉產纖維素酶最適產酶期的確定。每24ｈ取樣測定CMC酶活,結果見圖3。

從試驗結果可以看出,隨著菌體的生長,菌絲越來越多,酶活急劇升高,到第5ｄ達到產酶高峰,此后隨著菌絲老化,酶活力呈下降趨勢。

2.3　里氏木霉纖維素酶酶解最適pH及溫度的測定

纖維素酶與其它酶一樣,是一種由活細胞產生的生物催化劑,是一種蛋白質。環境pH、溫度對其活性有很大影響。在其它條件都相同的情況下,酶液在不同pH及溫度反應,結果(圖4、圖5)纖維素酶作用的最適pH為4 85、溫度50℃。

3結論

3.1　在固態發酵產纖維素酶培養基中加入一定量的雜細胞,有利于纖維素酶的產生,且酶活力很高。但添加量不宜過多,否則纖維素酶的合成反倒受阻礙。雜細胞、稻草粉、麩皮三者比例以2∶4∶4為好。

3.2　雜細胞、稻草粉、麩皮三者之比為2∶4∶4,硫酸銨作為氮源,料水比1∶2,28～30℃恒溫培養5d,為最佳產酶條件,其每克干曲的羧甲基纖維素酶活達516.64IU。表面活性劑Tween80對產酶無明顯促進作用。

3.3　纖維素酶作用的最適pH4 85、溫度50℃。

參考文獻:

[1]　輕工業部廣州輕工業學校,等.制漿造紙分析與檢驗[Ｍ].北京:中國輕工業出版社,1983.

[2]　張　夭.植物原料水解工藝學[Ｍ].北京:中國林業出版社,1982.

[3]　Doppelbauer R , Esterbauer  H , Sleimuuller . H. Lignocellulosic waste for production of cellulose by Trichoderma reesei [J] . Appl . Microbiol . Biotechnol,1987,26:485-494.

[4]　周仕強,等.慈竹、黃竹蒸煮工藝的研究[Ａ].竹材桿部結構及制漿工藝研究報告匯編[Ｃ],四川省造紙工業研究所,1987.

[5]　周江敏,陳華林,梁如玉,等.酶法水解雜細胞最適條件及酶回收利用[Ｊ].四川農業大學學報,2000,18(4):356-358.

[6]T K Ghose,.Measure ment of cellulose activities [J] . Pure and Appl. Chem,,1987,59(2):257-268.

[7]　齊義鵬.纖維素酶及其應用[Ｍ].成都:四川人民出版社,1979.