作者分離篩選到一株堿性脂肪酶產(chǎn)生菌Penicilliumexpansum WMC20718,并對其所產(chǎn)堿性脂

肪酶進行了分離純化｡測定了純酶的相對分子質(zhì)量､酶學特性和N末端20個氨基酸殘基序列｡經(jīng)計算機聯(lián)網(wǎng)檢索,與300多種已知N末端或全序列的脂肪酶比較,除了Pen. Expansum DSM1994堿性脂肪酶外,未發(fā)現(xiàn)有意義的同源性序列｡

1材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 脂肪酶 擴展青霉WMC20718菌株經(jīng)液體深層發(fā)酵,其發(fā)酵液經(jīng)離心､硫酸銨沉淀

和干燥等步驟,制成粗脂肪酶粉｡

1.1.2 試劑 乙腈､丙烯酰胺和N,N 雙叉丙烯酰胺 Fluka公司產(chǎn)品;TEMED Bio-Rad公司產(chǎn)品;苯基 –Sepharcse CL-4B､DEAE Sepharose fast flow､Sephadex G-75､G-150､藍色葡聚糖2000和細胞色素c Pharmacia公司產(chǎn)品;三氟乙酸 Merck公司產(chǎn)品;陰離子LAS､非離子AE09表面活性劑 中科院日化所太原發(fā)凱化工公司產(chǎn)品;堿性蛋白酶 浙江海寧酶制劑廠產(chǎn)品(酶活性單位1.0×105U/g)｡

1.1.3 儀器 SX-300快速成像儀 上海四星公司產(chǎn)品;HP-1100型液相色譜儀Hewlett Pachard公司產(chǎn)品;C3冷凍干燥機 美國VirTis公司產(chǎn)品;PHS-2C型精密酸度計 上海雷磁儀器廠產(chǎn)品;476A蛋白質(zhì) 多肽序列儀 ABI公司產(chǎn)品｡

1.2 純化方法

1.2.1 硫酸銨鹽析 離心上清液加硫酸銨至70%的飽和度,靜置4h,再以8000g離心20min收集蛋白質(zhì)沉淀,溶于少量水中,對含0.5mol/L硫酸銨的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)透析過夜｡

1.2.2 疏水層析 將透析液上樣到已用上述緩沖液預平衡的苯基-Sepharose CL- 4B層析柱

(D1.1cm×30cm)上,用同一緩沖液洗滌4個柱體積,再用含30%乙醇和5%甘油的20m

mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)進行洗脫,收集活性組分｡

1.2.3 陰離子交換層析 將收集的活性組分在透析袋中用聚乙二醇濃縮后,對50mmol L甘氨酸緩沖液(pH8.6)透析24h,上樣到已用同一緩沖液預平衡的DEAE Sepharose fast flow層析柱(D1.1cm×20cm)上,以含NaCl的同一緩沖液進行梯度洗脫｡

1.2.4 凝膠過濾 將經(jīng)DEAE Sepharose fast flow柱層析得到的高純度脂肪酶冷凍干燥后,在Sephadex- 75層析柱(D1.6cm×60cm)上以蒸餾水進行洗脫,收集的活性組分冷凍干燥､備用｡

1.2.5 高效反相色譜 酶蛋白的均一性檢測在HP-1100型高效液相色譜儀上進行,采用反相Zorbax300SB CN柱｡洗脫液體積流量:1.0mL min;洗脫液:溶劑A,0.1%TFA-H2O;溶劑B,0.085%TFA ACN｡

1.3 其它方法

1.3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)PAGE采用不連續(xù)垂直板狀電泳系統(tǒng)進行,分離膠質(zhì)量濃度7g/dL.SDS PAGE也采用不連續(xù)垂直板狀電泳系統(tǒng)進行,分離膠質(zhì)量濃度15g/dL｡

1.3.2 相對分子質(zhì)量測定 采用SDS-PAGE和凝膠過濾[9]兩種分離體系,分別測定堿性脂肪酶的相對分子質(zhì)量｡凝膠過濾在Sephadex G- 150柱(D1.6cm×60cm)上進行,洗脫液為20mmol L甘氨酸緩沖液(pH8.6),洗脫速度0.4mL min｡

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度測定 采用Lowry法進行測定,以牛血清白蛋白作標準｡

1.3.4 脂肪酶活性測定 測定方法和試劑配制參見文獻,每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1μmol L游離脂肪酸的酶量定義為一個脂肪酶國際單位(U)｡

1.3.5 N末端氨基酸序列測定1取5μg純化后的堿性脂肪酶,上蛋白質(zhì)/多肽序列儀進行

氨基酸殘基序列測定｡

2結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶的純化

預試驗結(jié)果表明,硫酸銨飽和度為70%時,上清液中僅殘留2%的酶活性.在200mL上清液中緩慢加入106g固體硫酸銨(70%飽和度),并不斷攪拌至溶解｡靜置4h后以8000g離心20min收集蛋白質(zhì)沉淀,溶于30mL緩沖液中,透析后得到36mL的粗酶樣品液｡該樣品在苯基

 -Selpharose CL- 4B上進行疏水層析,體積流量為24mL/h,每管體積為4mL,結(jié)果如圖1所示｡脂肪酶主要分布在第2個峰內(nèi)(第40至70管)｡通過苯基 –Sepharose CL- 4B的疏水層析分離,可除去大部分雜蛋白質(zhì)和色素｡

圖1 脂肪酶的Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析

圖 2 脂肪酸的DEAE Sepharose fast flow柱層析

將疏水層析收集的脂肪酶活性部分在DEAE Sepharose fast flow上進行陰離子交換層析,體積流量為18mL h,每管體積為3mL,洗脫曲線如圖2所示｡活性測定結(jié)果表明,第42管開始有酶活性,至第47管達到最大值｡進一步用PAGE檢測各收集管內(nèi)蛋白質(zhì)樣品的濃度和純度,結(jié)果見圖3｡44~52管內(nèi)組分呈單一蛋白質(zhì)條帶,而54~60管有3個條帶｡將3個條帶分別從膠上回收后測定酶活性,結(jié)果表明,這3個條帶都有酶活性,是理化性質(zhì)很接近的堿性脂肪酶同工酶｡將42至52管合并,用聚乙二醇透析濃縮至4mL｡

將濃縮液分2次用Sephadex G- 75柱層析進一步提純,洗脫結(jié)果見圖4,呈現(xiàn)一個對稱的蛋白質(zhì)吸收峰,樣品酶活性測定采用固體瓊脂平板法,酶活性與蛋白質(zhì)吸光度(OD280)呈對應關系｡收集具有酶活性的各管,冷凍干燥后得到純度較高的粉狀脂肪酶,經(jīng)SDS-PAGE和RP-HPLC檢測,均達到了SDS-PAGE和RP-HPLC純,可用于N末端氨基酸序列測定｡

2.2 脂肪酶的純化倍數(shù)和比活性

WMC20718菌株發(fā)酵液經(jīng)表1各步驟分離純化后,冷凍干燥得到了比活性為4200U/mg的堿性脂肪酶,純化倍數(shù)18.5,得率48.8%｡

表1 擴展青霉WMC20718堿性脂肪酶的分離純化

   注:冷凍干酶粉比活性的下降是由于冷凍干燥過程中酶的微量失活所致｡2

.3 N末端氨基酸序列

N末端20個氨基酸殘基的序列為:NH2- Ala-Thr-Ala-Asp-Ala-Ala-Ala-Phe-Pro-Asp-Leu-His-Arg-Ala-Ala-Lys-Leu-Ser Ser-Ala ｡將N末端20個氨基酸序列與Jaeger和Yamaguchi等報道的Pseudomonas aeruginosa 和Penicillium camembertii U-150所產(chǎn)脂肪酶的N末端氨基酸序列比較后,未發(fā)現(xiàn)有相同之處｡同時經(jīng)計算機檢索與300多種已知脂肪酶的N末端氨基酸序列比較,除了Pen.expansum D S M1994堿性脂肪酶外,未發(fā)現(xiàn)有效同源性｡

2.4 相對分子質(zhì)量測定

分別采用SDS-PAGE和Sephadex G-150凝膠過濾,測得該酶的相對分子質(zhì)量為27500(圖5)和28200(圖6),表明該酶以單體形式存在,不存在多聚體｡

2.5 pH值對酶活性的影響

在不同pH值條件下(溫度30℃)測定酶活性｡結(jié)果表明,該酶的最適pH值為10.0｡另取一定量純化的酶液與不同pH值的緩沖液等體積混合,30℃保溫30min后測定其殘余酶活性｡該酶具有較寬的穩(wěn)定pH值范圍,在pH6.5~10.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的酸堿穩(wěn)定性｡

2.6 溫度對酶活性的影響

在pH值為10.0條件下,測定了在不同溫度下相同酶量的活性｡結(jié)果表明該脂肪酶的最適反應溫度為30℃｡將相同量的酶在最適pH值條件下,以不同溫度處理30min后,30℃條件下測定其殘余酶活性｡45℃處理30min僅殘留30%的酶活性,但在35℃以下可保留近100%的酶活性｡

2.7 堿性蛋白酶對脂肪酶活性的影響

洗滌劑中堿性脂肪酶及蛋白酶的添加量一般在800~1000Ug,按每升水加5g洗滌劑計,洗滌溶液中脂肪酶和蛋白酶活性在4~5U mL｡實驗中將脂肪酶單位控制在5U mL,與不同活性堿性蛋白酶､在不同溫度下作用30min后,測定其殘余酶活性(以相對酶活表示),結(jié)果如圖7所示｡隨著蛋白酶活性和溫度的升高,脂肪酶殘余活性有所下降｡蛋白酶活性在10U mL以下對脂肪酶殘余活性的影響較小,因此可以認為該酶在有蛋白酶存在的情況下具有良好的穩(wěn)定性｡

圖7 洗滌劑中蛋白酶對脂肪酶活性的影響

2.8 表面活性劑對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

分別將非離子和陰離子表面活性劑AEO9和LAS配成質(zhì)量濃度為20g/L的水溶液,將脂肪酶于30℃條件下處理30min,測定殘留酶活性｡

表2結(jié)果表明,陰離子LAS對酶活性影響較大,而非離子AEO9對酶活性無影響,且抵消陰離子LAS對酶活性的影響｡

表2 表面活性劑對WMC20718脂肪酶穩(wěn)定性的影響

溫度､pH值､堿性蛋白酶及表面活性劑等對該純化脂肪酶活性影響的研究結(jié)果表明,該酶與Yuzo等報道的Pseudomonas fluorescens所產(chǎn)堿性脂肪酶的特性相類似,這些酶學特性使得該酶非常適合作為洗滌劑用酶｡相對來說WMC20718脂肪酶的最適作用較低,適合在常溫下洗滌,但在耐陰離子表面活性劑等性能上不如P.fluorescens脂肪酶｡

3結(jié)論

擴展青霉WMC20718發(fā)酵液中除了目的堿性脂肪酶之外,還存在其它蛋白質(zhì)和雜質(zhì)｡根據(jù)不同蛋白質(zhì)存在疏水性､電荷和相對分子質(zhì)量大小等物理性質(zhì)方面的差異,對脂肪酶進行了分離純化｡獲得高純度的堿性脂肪酶,研究其物理化學性質(zhì),是進一步從分子水平研究該酶的結(jié)構(gòu)與功能的關系､酶結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控元件的序列分析和改造等必不可少的一步｡研究中測定了純化脂肪酶N末端的氨基酸序列,為進一步克隆該脂肪酶基因提供了重要的生物信息｡目前,作者正在克隆該脂肪酶基因,目的是將其克隆到米曲霉或畢氏酵母中,期望能進一步提高微生物的產(chǎn)酶能力和改善酶的特性｡

近年來,利用堿性脂肪酶水解脂肪而使其脫離纖維的達到去除污垢的效果,已引起了人們的極大興趣｡尋找一種在洗滌過程中穩(wěn)定､高活性的脂肪酶,提高三酰甘油酯的去除率是研究堿性脂肪酶的主要目的之一｡對WMC20718所產(chǎn)脂肪酶的最適溫度､最適pH值､耐蛋白酶及表面活性劑等特性的研究表明,該酶適用于洗滌劑中｡

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