在科學研究中 , 經常遇到表面活性劑和蛋白質的相互作用問題 , 而表面活性劑對蛋白質的變性作用非常復雜 , 有人曾研究過表面活性劑與酶的相互作用 , 利用 SDS 在等電點以下沉淀蛋白質 , 而等電點以上的蛋白質不被沉淀的原理 , 分離了某些蛋白質的混合物 , 且一次分離達到電泳純 。 也有人指出 , 表面活性劑和蛋白質的結合 , 使蛋白質的二級有序結構 ( α螺旋 , β折疊等 ) 增加或減少 , 或不影響蛋白質的二級結構 。 表面活性劑對蛋白質活力和構象的影響與表面活性劑的類型有關 。
本文試驗了非離子表面活性劑 (Tween 80), 陽離子表面活性劑 (CTAB,CPB), 陰離子表面活性劑 (SDS,LAS) 對 BSA 的變性作用 。 在不同實驗條件下 , 經紫外掃描以及測定 BSA 在 280nm 處的吸光度值的變化來解析 BSA 光譜性能的改變 。 結果發現 , 在臨界膠束濃度附近 , 幾種表面活性劑對 BSA 有穩定和保護作用 , 為在雙水相､非有機溶劑液固萃取以及泡沫浮選中 , 用表面活性劑分離蛋白質 , 做了一些基礎研究工作 。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
UV-240 型紫外 - 可見分光光度計 ( 日本島津 );pHS-3 型酸度計 ( 上海第二分析儀器廠 );Tween80(上海三浦化工有限公司 ) 化學純 ;CPB( 上海計劃生育科學研究所 ) 化學純 ;CTAB( 湖南湘中化學試劑開發中心 ) 分析純 ;SDS( 武漢化學試劑廠 ( 進口分裝 )) 分析純 ;LAS( 上海化學試劑采購供應站 ) 化學純 ;BSA( 武漢中健科技發展有限公司 ( 進口分裝 ))。
1.2實驗方法
1.2.1 確定表面活性劑濃度的方法
將 5 種表面活性劑分別配成不同濃度的系列溶液 。 在 1.0cm 比色皿中 , 加入 1.0mg/mL 的 BSA 溶液 1.5mL, 加入一定量的表面活性劑溶液 , 用二次水補至 3.0mL, 混勻 , 在 190~380nm 處掃描 。
1.2.2 緩沖溶液的配制
磷酸氫二鈉與檸檬酸系列緩沖溶液 , 甘氨酸與鹽酸緩沖液 , 甘氨酸與 NaOH 緩沖液均按文獻配制 。
在 pH1.30~9.64 范圍 , 試驗了酸度對 3 種表面活性劑與 BSA 作用的影響 。BSA 與 5 種表面活性劑作用的濃度均為500μg/mL。若作用后 ,280nm 處無特征吸收峰 , 則稱為 BSA 變性 。
2 結果與討論
2.1 表面活性劑濃度的影響
表 1 5 種表面活性劑的臨界膠束濃度和使 BSA 變性的濃度 
*: 當 CTAB 和 SDS 的濃度分別達 0.2 和 0.4mol/L 時 ,BSA 仍未變性 。
Tween 80,CTAB,CPB,SDS,LAS 的臨界膠束濃度 (CMC) 和使 BSA 變性的濃度如表 1。
表 1 說明 Tween 80 的濃度在 1%~1.0×10-3% 之間變化 , 對 BSA 在 280nm 處的吸收峰沒有影響 , 陰､陽離子表面活性劑的濃度由低到高變化時 ,280nm 處吸收峰逐漸增高 , 在臨界膠束濃度附近達最高 , 大于臨界膠束濃度后 , 峰高又有所降低 。 實驗結果表明 ,5 種表面活性劑與 BSA 作用的最佳濃度分別為 :Tween80:0.05%( 體積百分比);CTAB:1×10-4mol/L;CPB:5×10-5mol/L;S
DS:5×10-3mol/L;LAS:1×10-3mol/L。 圖 1 是 BSA 在 280nm 處的特征吸收 ; 圖 2 明 ,Tween80,CTAB ､ SDS 在紫外無特征吸收峰 ; 圖 3 顯示 ,CPB 和 LAS 在紫外均有特征吸收峰 ; 圖 4 為 Tween80 ､ CTAB ､ SDS 在最佳濃度時分別與 BSA 的混合物紫外吸收譜圖 。
室溫下 , 當 CTAB 的濃度 >0.2mol/L,SDS 的濃度 >0.4mol/L 時 ,BSA 在 280nm 處仍有明顯的特征吸收峰 , 峰高比未加表面活性劑時略有降低 , 說明 CTAB 和 SDS 的加入 , 對 BSA 在紫外的吸收無顯性影響 , 而 Tween80 濃度小于 1% 時 , 對 BSA 在 280nm 處的吸收峰沒有影響 。 因此可采用這 3 種表面活性劑對蛋白質混合物進行浮選分離 。
2.2 作用時間的影響
試驗了不同濃度的 Tween80,CTAB 和 SDS 與 BSA 的混合溶液 , 于 280nm 處的吸光度值隨時間的變化 。室溫 ,pH6.00~7.00 條件下 ,15h 內 ,Tween80 濃度小于 0.05%, 對 BSA 的吸光度值沒有影響 。 而 CTAB 和 SDS 在臨界膠束濃度附近 , 對 BSA 在 280nm 處的吸光度值也沒有影響 ; 當 CTAB 濃度小于 1×10-6mol/L,SDS 濃度小于 2×10-4mol/L, 時間超過 30h,280nm 處的吸光度值逐漸降低 ; 而 CTAB 濃度大于 5×10-2mol/L,SDS 濃度大于 5×10-2mol/L,Tween80 濃度大于 0.1%, 時間超過 15h,280nm 處的吸光度值就顯著降低 。15h 內 , 在臨界膠束濃度附近 ,3 種表面活性劑使 BSA 在 280nm 處的吸光度值不變 , 說明在臨界膠束濃度附近 , 這 3 種表面活性劑對 BSA 有保護作用 。
2.3 酸度的影響
實驗結果顯示 , 用 pH4.50~6.00 之間的磷酸緩沖液時 ,3 種表面活性劑與 BSA 的混合液在 280nm 處的吸光度值比 BSA 在 280nm 處的吸光度值略高 , 而用 pH2.50~4.00 的磷酸氫二鈉 - 檸檬酸緩沖液或 pH7.00~9.00 的甘氨酸 -NaOH 緩沖液時,280nm 處的吸光度值偏低 , 與 BSA 在 280nm 處的吸光度值偏差為± 0.02。 在實驗的 pH 范圍內 , 酸度對表面活性劑與 BSA 之間的作用影響不大 , 也沒有使 BSA 沉淀 。表明非離子型表面活性劑 Tween 80, 在實驗的酸度條件下均不沉淀蛋白質 ; 濃度較高的離子型表面活性劑 CTAB 和 SDS, 在實驗的酸度范圍內也不會引起蛋白質沉淀 。此結果與文獻的報道類似 。
綜上所述 , 表面活性劑與蛋白質的作用各有不同 ,LAS 與 BSA 作用時 , 酸度影響很大 , 當 pH 小于 4.50,LAS 與 BSA 產生白色絮狀沉淀 , 不適于泡沫浮選分離 。于室溫 , 中性溶液中 ,Tween 80 濃度 <5%,CTAB 濃度 <0.2mol/L,SDS 濃度 <0.4mol/L,CPB 在臨界膠束濃度附近 , 適于蛋白質混合物的泡沫浮選分離 。 另外 , 蛋白質和表面活性劑的種類 , 還需進一步探討 , 以便為泡沫浮選分離蛋白質提供實驗指導。
