雙水相體系(Aqueous two-phase systems,簡稱ATPS)是指某些物質(zhì)的水溶液在一定條件下自發(fā)分離形成的兩個互不相溶的水相.由于其兩相都是水溶液,可作為萃取體系用于生物活性物質(zhì)的萃取分離及分析.我們曾報道了正､負離子表面活性劑雙水相體系用于蛋白質(zhì)的分離.當正､負離子表面活性劑與某些水溶性高聚物混合時,也可形成雙水相體系.該類雙水相體系可望結(jié)合高聚物雙水相與正負離子表面活性劑雙水相體系的優(yōu)點,作為新的萃取體系,可用于生物活性物質(zhì)的分離及分析.
本文報道了正､負離子表面活性劑(溴化十二烷基三乙銨/十二烷基硫酸鈉)與高聚物(葡聚糖､聚乙二醇)混合雙水相體系的形成､相行為及牛血清蛋白和溶菌酶在雙水相體系中的分配以及血紅蛋白在親和雙水相體系中的親和分配.
1 實驗部分
1.1 試 劑
十二烷基硫酸鈉(C12H25SO4Na,SDS,FLUKA公司)經(jīng)乙醇/水混合溶劑重結(jié)晶.溴化十二烷基三乙銨[C12H25N(C2H5)3Br,C12NE]由溴代十二烷和三乙胺反應(yīng)制得,其方法參見文獻.SDS及C12NE均未發(fā)現(xiàn)表面張力最低點,說明無其它高表面活性雜質(zhì).所用高聚物聚乙二醇(分子量40000)及葡聚糖(分子量5000000),均為PHAMARCIA公司產(chǎn)品.帶有親和配基的高聚物PEG-IDA-Cu(IDA為iminod iacetate)的合成參照文獻.牛血清蛋白(不含脂肪酸,BSA)購于Sigma公司,溶菌酶(lysozyme, Boehringer公司)從蛋清中提取.水由去離子水加高錳酸鉀重蒸,其余試劑均為分析純.
1.2 實驗方法
不同物質(zhì)按表1—表3所示的比例混合,于恒溫水浴中放置24h以上,用肉眼觀察相分離.表面活性劑雙水相形成的判斷標準:(1)各相無渾濁或沉淀;(2)兩相間存在清晰的界面.表面活性劑的總濃度用表面張力方法測定,葡聚糖的濃度用旋光法測定.聚乙二醇濃度由折光率法測定.
1.2.2 兩相中蛋白質(zhì)濃度､分配系數(shù)及表面張力的測定
在UV-Vis光譜中測定λ=280nm處的吸收,確定BSA和溶菌酶濃度;測定λ=409nm處的吸收,確定血紅蛋白濃度.蛋白質(zhì)分配用分配系數(shù)K(K=ct/cb,ct和cb分別是上下兩相被分離蛋白質(zhì)的平衡濃度)表示.由滴體積法測定表面張力.
2 結(jié)果與討論
2.1 雙水相體系的形成及相行為
表1為雙水相體系中兩相的組成.表面活性劑濃度ctotal(C12NE-SDS)=0.075mol/L(以C12NE與SDS的總濃度表示).n(C12NE)/n(SDS)=1.85/1,w(高聚物)=3%.由表1可見,表面活性劑與高聚物分別富集于不同相中.
在正負離子表面活性劑雙水相體系中加入高聚物后,由于其體系粘度增加,導致相分離時間增加,而相體積比則隨高聚物的加入而下降(表2).
由20~
加入無機鹽對雙水相體系的影響與升溫相似(表3),亦有利于雙水相的形成,即無機鹽的加入不僅提高了相分離速度,也可使一些原來不分相的體系分相,并可降低相體積比.
對C12NE-SDS與聚葡糖雙水相體系,加入無機鹽亦有相似的變化規(guī)律.
2.2 蛋白質(zhì)在雙水相體系中的分配及親和分配
BSA和溶菌酶在不同雙水相體系中的分配系數(shù)見表1.在雙水相體系中,以Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖溶液,調(diào)節(jié)Na2HPO4和NaH2PO4的比例,維持溶液的pH為7.1.由分配系數(shù)可知,不同蛋白質(zhì)富集于不同的相中,牛血清白蛋白富集于上相,而溶菌酶則富集于下相.
IDA-Cu對蛋白質(zhì)表面的酪氨酸(Histidine)有特殊的親和作用.將其接在聚乙二醇上,加入正負離子表面活性劑與聚乙二醇共組雙水相體系中,則帶有親和配基的聚乙二醇出現(xiàn)在雙水相的下相(聚乙二醇富集相).由此可對具有較多表面酪氨酸的蛋白質(zhì)如血紅蛋白進行親和分配.當親和配基濃度分別為0,0.1,0.3,0.4,0.7,0.9mol/L時,血紅蛋白在正負離子表面活性劑與聚乙二醇共組雙水相體系中的分配系數(shù)分別為9.3,2.2,1.1,0.7,0.7,0.7.表明親和配基的引入可使血紅蛋白由上相311No.1肖進新等:正負離子表面活性劑與高聚物混合雙水相體系的相行為及蛋白質(zhì)的分配(未加親和配基)轉(zhuǎn)移到下相.
通常認為,由于不同種類高聚物具有不相容性,即不同高聚物形成的空間結(jié)構(gòu)不能相互滲透而導致分相.前文提到,在正負離子表面活性劑雙水相中,一相為表面活性劑富集相,另一相表面活性劑濃度很低.富含表面活性劑相呈現(xiàn)絮凝膠團,絮凝膠團組成的三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)中含有大量的水,當加入高聚物后,表面活性劑的絮凝膠團與高聚物的空間結(jié)構(gòu)不能相互滲透而導致分相,使表面活性劑與高聚物分別富集于不同相中.由此可解釋正負離子表面活性劑與高聚物混合雙水相的形成.
對于表面活性劑富集相,相的體積由絮凝膠團組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所結(jié)合的水的體積決定.當升溫時,膠團表面的水化層被削弱,加入無機鹽則壓縮了膠團表面的雙電層,兩種因素均導致絮凝膠團組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合水的能力下降.由此可解釋升溫和加入無機鹽對雙水相相體積比的影響.
在pH=7.1時,BSA帶負電(其表面靜電荷為-18),溶菌酶帶正電(其表面靜電荷為+7).由于雙水相體系中陽離子表面活性劑(C12NE)過量,因此表面活性劑膠團帶正電.由此可解釋BSA和溶菌酶在不同相中的富集現(xiàn)象.
與單一高聚物雙水相和正負離子表面活性劑雙水相體系相比,表面活性劑與高聚物混合雙水相體系可結(jié)合二者的優(yōu)點.高聚物雙水相體系的缺點是不適于非水溶性蛋白質(zhì)的分離.正負離子表面活性劑雙水相體系的缺點是不易在表面活性劑濃度很低的一相中固定親和配基.對表面活性劑與高聚物混合雙水相體系,可望通過表面活性劑溶液的加溶作用使其用于非水溶性蛋白質(zhì)的分離,由于表面活性劑與高聚物分別富集于不同的相中,可望在表面活性劑與高聚物上分別接親和配基而進行親和分配.
